SCIENCEADVANCES
IF:13.
24July
导读
今天读一篇关于秃头的文献，文章来自北卡罗莱纳州立大学生物医学工程系程柯团队。细读这篇文献其实是把相关已知的条件梳理后，进行了可预测范围内的套路化的验证，Duang就是一篇13分的文章。总的来说，全篇论证比较严谨，细胞2D向3D培养模式的转变也是近来热点和未来趋势，文中动物模型的处理和分组方式值得我们参考。同时也提醒我们如果做好文献梳理和课题设计，这样的工作量似乎也能够完成。（YYing...XD）。
临床一线用药米诺地尔通过增加的血流量导致细胞膜的超极化，以使营养物质到达毛囊。然而，毛乳头DP细胞对毛囊再生有重要的诱导能力，如果DP细胞保持休眠，毛发再生则很少发生，外用药物效果有限。外源性补充DP细胞能够支持毛发生长和调节毛发周期。但是，DP细胞体外培养后诱导能力下，有报道称DP细胞在3D球状培养后诱导能力恢复。
本篇作者进一步对比了2D-DP和3D-DP的分泌蛋白组合外泌体的表达差异，验证了两者外泌体中差异性表达的miR--5p，通过wnt/β-catenin（miR--5p-wnt/β-catenin已经报道）在3D-DP促毛发再生中的重要作用。
SUMMARY
毛乳头（DP）细胞支持毛发生长和调节毛发周期。然而，在体外培养下它们逐渐失去了诱导能力。DP细胞经过球形培养后，能部分恢复促进毛发再生的能力。本文结果显示与单纯的DP细胞或米诺地尔治疗相比，DP球状体能够有效地诱导毛囊周期从休止期到生长期的进程。由于旁分泌信号在这一过程中的重要性，我们从DP细胞培养物中分离出分泌蛋白和外泌体，并对其治疗效果进行了研究。我们证明miR--5p在DP球状体衍生的外泌体中显著上调。DP球形培养衍生的外泌体使得β-catenin上调，促进毛囊的发育。
INTRODUCTION
1.已知毛乳头细胞DP调节毛发的周期和再生,在体外培养下DP会逐渐失去诱导能力。DP细胞经过球形培养后，促进毛发再生的能力部分恢复。
在生长期，毛囊膨出区是活跃生长的毛乳头（DP）细胞的丰富来源，这些细胞在静止期脱落。秃顶地区的毛囊并没有消失，而是体积缩小。因此，向脱发区域补充DP细胞可以诱导毛发生长休止期至生长期阶段转变。DP细胞作为毛囊单位的主要间充质成分，可诱导毛囊从休止期向生长期的转变和新毛囊的形成。
二维培养的DP细胞对毛囊生长没有治疗作用，DP细胞必须聚集到毛囊区域才能发挥作用，3D球状体培养可部分恢复DP细胞的诱导能力，诱导人皮肤的新生毛囊()。
Q1:该再生过程中的分子机制尚需全面了解
2.已知DP细胞可通过分泌蛋白和外泌体与周围环境交流，诱导毛发周期和再生。通过3D培养可以富集分泌蛋白和外泌体中的miRNA，且已被证明对毛发再生有效。
DP细胞诱导毛发周期和再生，这需要与周围环境的相互交流。最近，DP细胞来源的分泌蛋白和细胞外囊泡已被证明促进毛发生长。与间充质干细胞相比,DP细胞来源衍生外泌体被证明是TGFβ激活剂，并且能促进人毛囊DP细胞增殖和毛发再生。3D培养已被证明是一种富集分泌蛋白组中某些蛋白质和miRNAs的方法。Young证明，来自3D培养DP细胞的外泌体(3DDP-eEXO)促进了DP细胞和外根鞘细胞的增殖，并增加了DP细胞中生长因子的表达。
Q2:DP球状体和DP细胞分泌组或外泌体的差异表达可能是调节毛囊周期的关键。
科学问题：2D-DP细胞和3D-DP细胞中差异表达的分泌蛋白组和miRNA。以及3D-DP细胞或3D-DP-EXO促进毛发再生的可能机制尚未被证实。
RESULTS1.DP球状体在体外和体内移植中增强β-catenin和CD的表达图1:3D-DP球状体的制备与表征。（A-B）小鼠毛乳头细胞的分离，传统培养可使2D-DP细胞生长。（C-D）在超低细胞培养瓶中生长DP球状体。CD（绿色）和β-连环蛋白（红色）的双重染色。（E和F）角蛋白和3D球状体加载角蛋白的扫描电镜。（G-I）示意图，将2D和3D的DPs分别悬浮于PBS或角蛋白后，在小鼠背部分区注射，用DiD标记细胞，观察细胞保留率（活体成像系统（IVIS）图像），发现3D球/角蛋白的保留时间最长。在2D培养的DP细胞中CD和β-catenin的表达较低。在3D培养后，由于细胞-细胞接触的增加，β-catenin表达增强。CD阳性DP细胞在体内表现出诱导毛发的能力。补充背景：1.C57BL/6小鼠在毛发生理学，C57背部脱毛后，该区域的所有毛囊都进入退行期（catagen），且皮肤只在生长期产生色素。2.超低附着培养皿表面是一种共价结合的水凝胶层，具有亲水性和中性带电。由于蛋白质和其他生物分子通过疏水和离子相互作用被动吸附到表面，这种水凝胶表面通过这些力抑制细胞附着。3.毛发衍生的自体角蛋白水凝胶作为细胞培养支架，可降解，生物相容性强。2.DP球状体促进了体内毛囊中β-catenin、CD和Ki67的表达图2:5%米诺地尔局部治疗、2D-DP细胞或3D细胞球的注射（10次一次性注射，均匀分布在治疗侧，每次20μl的个细胞）治疗对毛囊的效果比较（A-B）脱毛小鼠左侧治疗，右侧未治疗，10天后检测各组中β-catenin、CD、Ki67在在处理部位和未处理部位的表达。2D-DP细胞和3D-DP球状体两者均显示细胞在未处理部位的迁移，且与米诺地尔相比，未处理侧的β-连环蛋白、CD和Ki67的表达增强。且DP球状体显示出更强的β-catenin和CD染色组。米诺地尔并没有改变β-catenin或CD在两侧的表达。在治疗侧，5%米诺地尔在第10天促进Ki67的表达，但不促进β-catenin和CD，表明整个毛囊细胞的增殖和生长是非特异性的。只有米诺地尔组在治疗侧和未治疗侧之间Ki67的表达有显著差异。米诺地尔的作用机制不是直接调节DP细胞，而是促进血管生成，直接导致毛囊细胞增殖，而对DP细胞未处理侧的有益作用可能是由于DP细胞的旁分泌效应。以上研究表明，植入细胞不仅影响注射部位的毛囊，而且能促进未治疗部位的毛囊生长。DP球状体对毛囊生长的调节最为有效。3.DP球状体处理促进C57BL/6小鼠毛发再生图3：C57BL/6小鼠背部毛发生长实验。（A）将小鼠分为5组，左侧治疗（阳性对照组米诺地尔连用9天，细胞组第一天单词细胞注射），毛发覆盖的观察。（B）第10天、第15天和第20天毛发覆盖量化。左侧治疗。验证3D球状DP对毛囊诱导能力。在第15天，未治疗组仅为10%，米诺地尔治疗组的毛发覆盖率为35%。DP球状体/PBS组的毛发覆盖率平均为40%，DP球状体/角蛋白组的毛发覆盖率约为90%。且DP球状体/角蛋白治疗组毛囊更大，胶原分布更多。4.DP球状体通过上调β-catenin加速毛囊生长期的启动图4：免疫印迹和免疫组织学与各种治疗（A-B）第20天背部皮肤中的β-连环蛋白、p-Erk1/2、Erk1/2、SFRP2和GAPDH蛋白质含量。（C-E）SFRP2和β-catenin的免疫荧光共染色。DP球状体组中β-catenin和p-Erk1/2↑，SFRP2↓。这些结果表明DP球状体可能通过上调WNT通路中的β-catenin信号来激活毛囊发育。据报道，WNT/β-catenin途径通过促进毛发生长在调节毛发周期中具有关键作用。β-连环蛋白是生长期的主要起始剂。SFRP2通过下调β-连环蛋白在核易位中的表达，参与多种细胞活动和生物过程。5.DP细胞和DP球状体分泌蛋白和miRNA图谱的比较图5:从DP细胞和DP球状体中分离和检测分泌蛋白组和分泌体（A）DP球状体通过迁移和细胞因子和外泌体的分泌促进毛发周期从退行期到休止期的转变和调节间充质上皮的相互作用。在生长期，毛囊内有大量生长的DP细胞。退行性变时DP细胞脱落。DP细胞的补充促进生长期的发生。（D）miRNA阵列发现DP球状体-EXOs表达miR--5p的水平明显高于DP-EXOs。（E）图示FGF2和TIMP2驱动的毛囊调节和miR--5p诱导的毛囊发育促进的示意图。bFGF可被细胞膜上的FGFR接受并上调p-Erk1/2的表达，其上调β-catenin的表达。TIMP2可以抑制基质金属蛋白酶2（MMP2）的表达，MMP2这可能会阻碍DP细胞的迁移和增殖。与2D细胞分泌组相比，球形分泌组bFGF和TIMP2水平大约增加了一倍。此外，与2D-DP-EXOs相比，3D-DP-EXOs中miR--5p上调了25倍。6.DP球状体-衍生的外泌体治疗毛发再生图6:外泌体注射对毛发再生的影响。（A-B）3D-DP-EXOs比米诺地尔和2D-DP-EXOs更有效地促进毛囊生长。（C-D）不同治疗组皮肤样本上SFRP2（绿色）和β-连环蛋白（红色）的免疫荧光共染色。（E-F）分别在对照、miR--5p模拟物和抑制剂注射后的第20天成像。第15天三组毛发覆盖率（%）。（G）miR--5p富集的外泌体和通过体内PEI传递的miR--5p模拟物可转染miR--5p以靶向SFRP2，从而上调WNT/β-catenin途径；miR--5p抑制剂将在一定程度上阻断该信号。miR--5p的遗传结构表明，miR--5p具有靶向性直接使用SFRP2。miR--5p在外泌体中的差异表达可能与3D-D具有更高的促进毛发生长的作用相关。2D-DP-EXOs的治疗效果与米诺地尔没有显著差异，而3D-DP球状体-EXOs在某种程度上可以与细胞治疗相当。已有文献报道，miR--5p直接靶向SFRP2，上调WNT/β-catenin途径。与用2D-DP-EXOs或米诺地尔处理的组相比，用DP球状体–EXOs处理的组中β-catenin表达增加，SFRP2下调，调节毛发生长周期。7.miR--5p在外泌体介导的毛发再生中起着重要作用由于miR-5p直接作用于SFRP2，miR--5p模拟物和抑制剂被用来进一步验证miR--5p的重要性。将mmu-miR-5p模拟物与聚乙烯亚胺（PEI）溶液混合。将PEI/阴性对照、PEI/模拟物或PEI/抑制剂多聚物溶液注射到脱毛小鼠的背部皮肤中（图6E）。与对照组和miR--5p抑制剂相比，miR--5p模拟物治疗后毛发再生效果显著,且能显著增加内源性β-catenin。毛发覆盖率达到50%到90%。但弱于外泌体治疗（95%到%毛发覆盖率）。外泌体还含有其他mirna和蛋白质。这部分数据表明，miR--5p过表达的外泌体通过下调SFRP2、WNT信号抑制剂和上调β-catenin来刺激WNT信号。在这项研究证明了DP球状体驱动着小鼠毛发周期从休止期到生长期的转变。miR--5p-过表达的外泌体加速了生长期的启动，通过下调WNT信号抑制物SFRP2调节毛囊发育，从而促进β-连环蛋白，形成正反馈环。3D培养为细胞治疗提供了一个潜在的途径。原文链接：